Gran parte del genoma umano è costituito da regioni regolatorie che controllano quali geni sono espressi in un dato momento all’interno di una cellula. Questi elementi regolatori possono trovarsi vicino a un gene bersaglio o fino a 2 milioni di paia di basi distanti dal bersaglio.
Per consentire queste interazioni, il genoma si avvolge in una struttura 3D che avvicina le regioni distanti. Utilizzando una nuova tecnica, i ricercatori del MIT hanno dimostrato di poter mappare queste interazioni con una risoluzione 100 volte superiore rispetto a quanto era possibile in precedenza.
“Utilizzando questo metodo, generiamo le mappe a più alta risoluzione del genoma 3D che siano mai state generate e ciò che vediamo sono molte interazioni tra potenziatori e promotori che non sono mai state viste in precedenza”, afferma Anders Sejr Hansen, il Underwood-Prescott Career Development Assistant Professor of Biological Engineering presso il MIT e autore senior dello studio. “Siamo entusiasti di poter rivelare un nuovo livello di struttura 3D con la nostra alta risoluzione”.
Le scoperte dei ricercatori suggeriscono che molti geni interagiscono con dozzine di diversi elementi regolatori, anche se sono necessari ulteriori studi per determinare quali di queste interazioni sono le più importanti per la regolazione di un dato gene.
“I ricercatori possono ora studiare in modo conveniente le interazioni tra i geni e i loro regolatori, aprendo un mondo di possibilità non solo per noi ma anche per dozzine di laboratori che hanno già espresso interesse per il nostro metodo”, afferma Viraat Goel, uno studente laureato del MIT e uno dei i principali autori del paper. “Siamo entusiasti di offrire alla comunità di ricerca uno strumento che li aiuti a districare i meccanismi che guidano la regolazione genica”.
Il postdoc del MIT Miles Huseyin è anche uno degli autori principali dell’articolo, che appare oggi in Genetica della natura.
Mappatura ad alta risoluzione
Gli scienziati stimano che più della metà del genoma sia costituito da elementi regolatori che controllano i geni, che costituiscono solo il 2% circa del genoma. Gli studi di associazione sull’intero genoma, che collegano le varianti genetiche a malattie specifiche, hanno identificato molte varianti che compaiono in queste regioni regolatorie. Determinare con quali geni interagiscono questi elementi regolatori potrebbe aiutare i ricercatori a capire come insorgono queste malattie e, potenzialmente, come trattarle.
La scoperta di queste interazioni richiede la mappatura di quali parti del genoma interagiscono tra loro quando i cromosomi sono impacchettati nel nucleo. I cromosomi sono organizzati in unità strutturali chiamate nucleosomi – filamenti di DNA strettamente avvolti attorno alle proteine - che aiutano i cromosomi ad adattarsi ai piccoli confini del nucleo.
Oltre un decennio fa, un team che comprendeva ricercatori del MIT ha sviluppato un metodo chiamato Hi-C, che ha rivelato che il genoma è organizzato come un “globulo frattale”, che consente alla cellula di impacchettare strettamente il proprio DNA evitando i nodi. Questa architettura consente inoltre al DNA di dispiegarsi e ripiegarsi facilmente quando necessario.
Per eseguire l’Hi-C, i ricercatori usano gli enzimi di restrizione per tagliare il genoma in molti piccoli pezzi e collegare biochimicamente i pezzi che sono vicini l’uno all’altro nello spazio 3D all’interno del nucleo della cellula. Quindi determinano le identità dei pezzi interagenti amplificandoli e sequenziandoli.
Mentre Hi-C rivela molto sull’organizzazione complessiva 3D del genoma, ha una risoluzione limitata per individuare interazioni specifiche tra geni ed elementi regolatori come gli esaltatori. I potenziatori sono brevi sequenze di DNA che possono aiutare ad attivare la trascrizione di un gene legandosi al promotore del gene, il sito in cui inizia la trascrizione.
Per ottenere la risoluzione necessaria per trovare queste interazioni, il team del MIT si è basato su una tecnologia più recente chiamata Micro-C, inventata dai ricercatori della University of Massachusetts Medical School, guidati da Stanley Hsieh e Oliver Rando. Micro-C è stato applicato per la prima volta nel lievito in erba nel 2015 e successivamente applicato alle cellule di mammifero in tre articoli nel 2019 e nel 2020 da ricercatori tra cui Hansen, Hsieh, Rando e altri presso l’Università della California a Berkeley e presso la UMass Medical School.
Micro-C raggiunge una risoluzione più elevata rispetto a Hi-C utilizzando un enzima noto come nucleasi micrococcica per tagliare il genoma. Gli enzimi di restrizione di Hi-C tagliano il genoma solo in corrispondenza di sequenze di DNA specifiche che sono distribuite in modo casuale, risultando in frammenti di DNA di dimensioni variabili e maggiori. Al contrario, la nucleasi micrococcica taglia uniformemente il genoma in frammenti delle dimensioni di un nucleosoma, ognuno dei quali contiene da 150 a 200 paia di basi di DNA. Questa uniformità di piccoli frammenti garantisce a Micro-C la sua risoluzione superiore rispetto a Hi-C.
Tuttavia, poiché Micro-C esamina l’intero genoma, questo approccio non raggiunge ancora una risoluzione sufficientemente elevata per identificare i tipi di interazioni che i ricercatori volevano vedere. Ad esempio, se vuoi vedere come interagiscono tra loro 100 diversi siti del genoma, devi sequenziare almeno 100 moltiplicato per 100 volte, o 10.000. Il genoma umano è molto grande e contiene circa 22 milioni di siti alla risoluzione del nucleosoma. Pertanto, la mappatura Micro-C dell’intero genoma umano richiederebbe almeno 22 milioni moltiplicati per 22 milioni di letture di sequenziamento, con un costo superiore a 1 miliardo di dollari.
Per ridurre tale costo, il team ha escogitato un modo per eseguire un sequenziamento più mirato delle interazioni del genoma, consentendo loro di concentrarsi sui segmenti del genoma che contengono i geni di interesse. Concentrandosi su regioni che coprono pochi milioni di paia di basi, il numero di possibili siti genomici diminuisce di mille volte e i costi di sequenziamento diminuiscono di un milione di volte, fino a circa $ 1.000. Il nuovo metodo, chiamato Region Capture Micro-C (RCMC), è quindi in grado di generare in modo economico mappe 100 volte più ricche di informazioni rispetto ad altre tecniche pubblicate per una frazione del costo.
“Ora abbiamo un metodo per ottenere mappe della struttura del genoma 3D ad altissima risoluzione in un modo molto conveniente. In precedenza, era così inaccessibile finanziariamente perché avresti avuto bisogno di milioni, se non miliardi di dollari, per ottenere un’alta risoluzione”, afferma Hansen . “L’unica limitazione è che non puoi ottenere l’intero genoma, quindi devi sapere approssimativamente a quale regione sei interessato, ma puoi ottenere una risoluzione molto alta, molto conveniente”.
Molte interazioni
In questo studio, i ricercatori si sono concentrati su cinque regioni di dimensioni variabili da centinaia di migliaia a circa 2 milioni di paia di basi, che hanno scelto per le caratteristiche interessanti rivelate da studi precedenti. Questi includono un gene ben caratterizzato chiamato Sox2, che svolge un ruolo chiave nella formazione dei tessuti durante lo sviluppo embrionale.
Dopo aver catturato e sequenziato i segmenti di DNA di interesse, i ricercatori hanno trovato molti potenziatori che interagiscono con Sox2, così come interazioni tra geni vicini e potenziatori mai visti prima. In altre regioni, specialmente quelle piene di geni e potenziatori, alcuni geni hanno interagito con ben altri 50 segmenti di DNA e, in media, ogni sito di interazione ne ha contattati circa altri 25.
“Le persone hanno già visto interazioni multiple da un frammento di DNA, ma di solito è dell’ordine di due o tre, quindi vederne molte è stato piuttosto significativo in termini di differenza”, afferma Huseyin.
Tuttavia, la tecnica dei ricercatori non rivela se tutte queste interazioni si verificano contemporaneamente o in momenti diversi, o quali di queste interazioni sono le più importanti.
I ricercatori hanno anche scoperto che il DNA sembra avvolgersi in “microcompartimenti” nidificati che facilitano queste interazioni, ma non sono stati in grado di determinare come si formano i microcompartimenti. I ricercatori sperano che ulteriori studi sui meccanismi sottostanti possano far luce sulla questione fondamentale di come i geni sono regolati.
“Anche se al momento non siamo consapevoli di ciò che potrebbe causare questi microcompartimenti e abbiamo tutte queste domande aperte di fronte a noi, almeno abbiamo uno strumento per porre queste domande in modo davvero rigoroso”, afferma Goel.
Oltre a perseguire queste domande, il team del MIT prevede anche di lavorare con i ricercatori del Boston Children’s Hospital per applicare questo tipo di analisi alle regioni genomiche che sono state collegate a malattie del sangue negli studi di associazione sull’intero genoma. Stanno inoltre collaborando con i ricercatori della Harvard Medical School per studiare le varianti legate ai disordini metabolici.
La ricerca è stata finanziata dal Koch Institute Support (core) Grant dal National Cancer Institute, dal National Institutes of Health, dalla National Science Foundation, da un Solomon Buchsbaum Research Support Committee Award, dal Koch Institute Frontier Research Fund, da una NIH Fellowship e da un Borsa di studio EMBO.
Da un’altra testata giornalistica. news de www.sciencedaily.com
