Microscopia: superamento del tradizionale limite di risoluzione per il rapido co-tracking delle molecole

I processi all’interno del nostro corpo sono caratterizzati dall’interazione di varie biomolecole come proteine ​​e DNA. Questi processi si verificano su una scala spesso entro un intervallo di pochi nanometri. Di conseguenza, non possono essere osservati con la microscopia a fluorescenza, che ha un limite di risoluzione di circa 200 nanometri a causa della diffrazione. Quando due coloranti che segnano la posizione delle biomolecole sono più vicini di questo limite ottico, la loro fluorescenza non può essere distinta al microscopio. Poiché questa fluorescenza viene utilizzata per localizzarli, determinare con precisione la loro posizione diventa impossibile.

Questo limite di risoluzione è stato tradizionalmente superato nei metodi di microscopia a super risoluzione facendo lampeggiare i coloranti e accendendo e spegnendo la loro fluorescenza. Ciò separa temporaneamente la loro fluorescenza, rendendola distinguibile e consentendo localizzazioni al di sotto del limite di risoluzione classico. Tuttavia, per le applicazioni che coinvolgono lo studio di processi dinamici rapidi, questo trucco presenta uno svantaggio significativo: il lampeggiamento impedisce la localizzazione simultanea di più coloranti. Ciò diminuisce significativamente la risoluzione temporale quando si studiano processi dinamici che coinvolgono più biomolecole.

Sotto la guida del chimico della LMU, il professor Philip Tinnefeld, e in collaborazione con il professor Fernando Stefani (Buenos Aires), i ricercatori della LMU hanno ora sviluppato il multiplexing pMINFLUX, un approccio elegante per affrontare questo problema. Il team ha recentemente pubblicato un articolo sul loro metodo sulla rivista Nature Photonics. MINFLUX è un metodo di microscopia a super risoluzione, che consente localizzazioni con una precisione di appena un nanometro. A differenza del MINFLUX convenzionale, pMINFLUX registra la differenza temporale tra l’eccitazione dei coloranti con un impulso laser e la successiva fluorescenza con una risoluzione inferiore al nanosecondo. Oltre a localizzare i coloranti, ciò fornisce informazioni su un’altra proprietà fondamentale della loro fluorescenza: la durata della fluorescenza. Ciò descrive quanto tempo, in media, impiega una molecola di colorante per diventare fluorescente dopo essere stata eccitata.

“La durata della fluorescenza dipende dal colorante utilizzato”, spiega Fiona Cole, co-autrice della pubblicazione. “Abbiamo sfruttato le differenze nella durata della fluorescenza quando si utilizzavano coloranti diversi per assegnare i fotoni fluorescenti al colorante emesso senza la necessità di sbattere le palpebre e la conseguente separazione temporale.” A questo scopo, i ricercatori hanno adattato l’algoritmo di localizzazione e hanno incluso un modello di adattamento multiesponenziale per ottenere la separazione richiesta. “Ciò ci ha permesso di determinare la posizione di più coloranti contemporaneamente e di studiare processi dinamici rapidi tra più molecole con precisione nanometrica”, aggiunge Jonas Zähringer, anche lui co-primo autore. I ricercatori hanno dimostrato il loro metodo tracciando accuratamente due filamenti di DNA mentre saltavano tra diverse posizioni su una nanostruttura di origami di DNA, nonché separando i movimenti traslazionali e rotazionali di una nanostruttura di origami di DNA e misurando la distanza tra i siti di legame dell’antigene degli anticorpi. “Ma questo è solo l’inizio”, afferma Philip Tinnefeld. “Sono certo che il multiplexing pMINFLUX, con la sua elevata risoluzione temporale e spaziale, fornirà in futuro nuove conoscenze sulle interazioni proteiche e su altri fenomeni biologici.”