Rilevamento degli agenti patogeni più rapido e accurato sciogliendo il DNA

Non solo questo metodo è più veloce delle emocolture, ma ha anche una probabilità significativamente inferiore di generare falsi positivi rispetto ad altre tecnologie emergenti basate sul rilevamento del DNA come il Next Generation Sequencing.

Perchè importa?

È un’esperienza che hanno avuto molti genitori: porti tuo figlio dal medico, perché ha la febbre, magari tossisce o starnutisce. Tuo figlio ha un’infezione, dice il medico, ma non è chiaro se sia batterica o virale. A volte, il medico prescriverà antibiotici “per ogni evenienza”. A volte ordinano un prelievo di sangue per vedere se sono presenti batteri. A volte, il risultato tornerà negativo due o tre giorni dopo, a quel punto ti verrà chiesto di continuare a somministrare gli antibiotici a tuo figlio in modo che non inizino a coltivare batteri resistenti agli antibiotici nel suo corpo.

Lo stesso scenario si verifica nelle unità di terapia intensiva pediatrica e nei pronto soccorso, con una posta in gioco più alta, quando un bambino presenta sintomi di sepsi. In questo caso, fino al 30% dei pazienti riceve il trattamento sbagliato, il che li espone di fatto a un rischio maggiore di morte. Con la sepsi, la velocità è ancora più essenziale, poiché il rischio di mortalità aumenta del 4% per ogni ora in cui l’infezione non viene diagnosticata o trattata in modo impreciso.

I ricercatori hanno condotto uno studio clinico pilota su campioni di sangue di pazienti pediatrici e hanno dimostrato che i risultati del loro metodo corrispondevano esattamente ai risultati delle emocolture nel rilevamento della sepsi. Ma il loro metodo ha rilevato gli agenti patogeni da 7,5 ore a circa 3 giorni più velocemente rispetto all’emocoltura clinica. I test vanno oltre un semplice risultato positivo o negativo per quantificare la quantità di agente patogeno presente nei campioni.

Il metodo si basa sulla fusione digitale universale del DNA ad alta risoluzione, in cui il DNA viene riscaldato fino a quando non si separa. Ogni sequenza di DNA ha una firma specifica durante la fusione. Mentre il processo di fusione viene ripreso e analizzato, gli algoritmi di apprendimento automatico determinano quali tipi di DNA sono presenti nei campioni e identificano gli agenti patogeni.

Il gruppo di ricerca presenta i risultati nel numero del 21 febbraio di Il giornale di diagnostica molecolare.

“Questa è la prima volta che questo metodo viene testato su sangue intero di pazienti sospettati di sepsi. Quindi questo studio è un’anteprima più realistica di come la tecnologia potrebbe funzionare in scenari clinici reali”, ha affermato Stephanie Fraley, autrice senior dell’articolo e professore presso il Dipartimento di Bioingegneria Shu Chien-Gene Lay presso l’Università della California a San Diego.

Si stima che nel mondo un decesso su cinque sia dovuto a complicazioni legate alla sepsi. E il 41% di questi decessi avviene tra i bambini. La diagnosi precoce è fondamentale per la sopravvivenza della sepsi, poiché il rischio di mortalità aumenta del 4% per ogni ora in cui l’infezione non viene diagnosticata o trattata in modo impreciso.

In genere, i medici prescrivono antibiotici ai pazienti affetti da sepsi in attesa dei risultati delle emocolture. Ciò può portare alla resistenza agli antibiotici su tutta la linea.

“La conclusione è che non stiamo trattando sulla base delle prove”, ha detto Fraley. “E più trattiamo senza prove, più possiamo causare problemi non voluti. A volte trattiamo pazienti che hanno infezioni fungine o virali con antibatterici. Ciò può causare resistenza agli antibiotici e alterare il microbioma del paziente in modo significativo.”

Come funziona il metodo

Tutto è iniziato con un millilitro di sangue da ciascun campione di 17 pazienti nello studio clinico pilota. I campioni sono stati raccolti contemporaneamente ai campioni per le emocolture di neonati e bambini piccoli.

I ricercatori hanno perfezionato l’isolamento del DNA e i metodi di apprendimento automatico per ridurre o eliminare i segnali dal DNA umano rispetto al DNA patogeno nei campioni. “, ha detto Fraley.

Mridu Sinha, uno degli ex dottorandi di Fraley. Gli studenti e ora CEO di Melio, la startup da loro cofondata, hanno ottimizzato un algoritmo di apprendimento automatico per rilevare in modo affidabile la differenza tra le curve di fusione degli agenti patogeni e il rumore di fondo. L’algoritmo abbina le curve a un database di curve di fusione del DNA note. È anche in grado di rilevare le curve create da organismi non presenti in questo database, che potrebbero essere presenti in un campione se contiene agenti patogeni rari o emergenti.

I risultati non solo corrispondevano esattamente ai risultati delle emocolture provenienti dagli stessi campioni di sangue; inoltre non hanno prodotto falsi positivi. Al contrario, altri tipi di test che si basano sull’amplificazione dell’acido nucleico e sui database di sequenziamento del DNA di prossima generazione amplificheranno qualsiasi DNA presente, portando a falsi positivi. Spesso il DNA penetra nel campione dall’ambiente, dalle provette, dai reagenti, dalla pelle e altro ancora. La contaminazione del campione può causare problemi nel sapere come interpretare i risultati del test.

“Il nostro test ha incorporato processi di preparazione del campione, tecniche di progettazione del test e algoritmi che garantiscono il rilevamento solo del DNA di organismi intatti, il che è clinicamente rilevante”, ha affermato Sinha.

I prossimi passi includono la conduzione di uno studio clinico più ampio, nonché l’espansione del metodo ai pazienti adulti.

Fraley e Sinha hanno concesso in licenza la tecnologia alla UC San Diego e hanno cofondato la startup Melio per commercializzare il loro metodo.

“Vogliamo dare ai medici la possibilità di curare i loro pazienti sulla base non di dati aggregati, ma di dati individuali precisi e accurati, consentendo una medicina veramente personalizzata”, ha affermato Fraley.

Cos’è la fusione del DNA?

Il DNA nei campioni di sangue viene riscaldato provocandone lo scioglimento a temperature comprese tra 50 e 90 gradi Celsius, circa tra 120 e 190 gradi Fahrenheit.

Quando la doppia elica del DNA si scioglie, i legami che tengono insieme i filamenti del DNA si rompono. A seconda della sequenza del DNA, i legami hanno forze diverse e ciò cambia il modo in cui i filamenti si snodano l’uno dall’altro. Ciò crea un’impronta digitale unica dipendente dalla sequenza, che i ricercatori possono rilevare utilizzando un colorante speciale. Il colorante fa sì che il processo di svolgimento emetta luce fluorescente, creando quella che i ricercatori chiamano una curva di fusione, una firma unica per ogni tipo di agente patogeno.

In passato, la fusione del DNA ha prodotto curve semplici che venivano utilizzate principalmente per confermare il funzionamento di una reazione PCR, ma questo nuovo approccio fa avanzare la fusione per generare firme complesse di curve di fusione che sono uniche per le sequenze genetiche.

Il lavoro è stato finanziato dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases del National Institutes of Health (numero premio R01AI134982 al SIF), un premio alla carriera del Burroughs Wellcome Fund presso la Scientific Interface (numero premio 1012027 al SIF) e dalla ricerca clinica traslazionale dell’UCSD Sovvenzioni pilota dell’Istituto e dell’UCSD per accelerare l’innovazione sul mercato.

Citazione della Dott.ssa Karen Mestan, Capo della Divisione di Neonatologia presso il Rady Children’s Hospital e il Dipartimento di Pediatria dell’UC San Diego: “I risultati di questo studio soddisfano un’importante esigenza in pediatria, in particolare per i neonati e i bambini piccoli in condizioni critiche in cui i sintomi clinici I segni di batteriemia sono estremamente difficili da decifrare. In contesti di sepsi subclinica precoce, e anche di grave shock settico, il patogeno batterico è spesso difficile da identificare in modo accurato e tempestivo. Un test che fornisce maggiore affidabilità e tempi di risposta più brevi rispetto alla pratica attuale è urgentemente necessario.L’eventuale applicazione clinica di U-dHRM porterà a una riduzione dell’esposizione non necessaria agli antibiotici, alla prevenzione di effetti collaterali indesiderati e alla resistenza globale agli antibiotici, a una migliore gestione degli antibiotici, a una migliore e più rapida accuratezza diagnostica e a risultati pediatrici complessivamente migliori. infezione del sangue, potrebbe salvare vite umane.”