Una squadra a Oxford Dipartimento di Ortopedia, Reumatologia e Scienze Muscoloscheletriche di Nuffield (NDORMS) ha sviluppato un nuovo approccio per migliorare significativamente la precisione del sequenziamento dell’RNA. Individuano la fonte primaria di quantificazione imprecisa nelle letture brevi e lunghe Sequenziamento dell’RNA. Hanno introdotto il concetto di correzione degli errori del “voto a maggioranza”, portando a un miglioramento sostanziale nel conteggio molecolare dell’RNA.
Figura 1: Uno schema che mostra la correzione dell’errore di voto della maggioranza dell’UMI dell’omotrimero. Abbiamo costruito UMI con blocchi nucleotidici omotrimerici (composti da combinazioni di AAA, CCC, GGG, TTT). Valutando la somiglianza dei nucleotidi trimeri, gli errori di delezione, inserimento o sostituzione vengono identificati e corretti attraverso un sistema di “voto a maggioranza”, selezionando il nucleotide più frequente.
Il sequenziamento accurato del materiale genetico è fondamentale nella biologia moderna, in particolare per comprendere e affrontare le malattie legate ad anomalie genetiche. Tuttavia, le metodologie attuali incontrano limiti sostanziali. In un studio fondamentaleun consorzio internazionale di ricercatori, guidato da Adam Cribbs, professore associato di biologia computazionaleE Jianfeng SunRicercatore post-dottorato presso l’ Istituto Botnar, Università di Oxford, hanno sviluppato un metodo innovativo per correggere gli errori nell’amplificazione PCR, una tecnica ampiamente utilizzata nel sequenziamento ad alto rendimento. Individuando gli artefatti della PCR come la fonte primaria di quantificazione imprecisa, la ricerca, pubblicata in Metodi naturaliaffronta una sfida di lunga data nel generare conteggi assoluti accurati di molecole di RNA, che è cruciale per varie applicazioni nella ricerca genomica.
I ricercatori si sono concentrati sugli identificatori molecolari univoci (UMI), che sono sequenze oligonucleotidiche casuali utilizzate per rimuovere i bias introdotti durante l’amplificazione della PCR. Sebbene gli UMI siano stati ampiamente adottati nei metodi di sequenziamento, lo studio rivela che gli errori della PCR possono compromettere l’accuratezza della quantificazione molecolare, in particolare su diverse piattaforme di sequenziamento.
Jianfeng ha spiegato: ‘L’amplificazione PCR, essenziale per la maggior parte delle tecniche di sequenziamento dell’RNA, può introdurre errori, compromettendo l’integrità dei dati. Abbiamo affrontato questo problema sintetizzando i codici a barre UMI utilizzando blocchi nucleotidici omotrimerici, migliorando la correzione degli errori e consentendo una quantificazione quasi assoluta delle molecole di RNA, migliorando notevolmente la precisione del conteggio molecolare.’
Gli omotrimeri sono sequenze nucleotidiche costituite da tre basi identiche, ad esempio AAA, CCC, GGG. Valutando la somiglianza nucleotidica degli omotrimeri, gli errori vengono rilevati e corretti attraverso un metodo del “voto a maggioranza” (Figura 1).
Lo studio dimostra che gli UMI omotrimerici superano significativamente gli UMI monomerici tradizionali nel ridurre l’arricchimento delle pieghe false positive durante l’analisi di geni e trascritti espressi in modo differenziale (DEG e DET). Questo miglioramento è vitale per identificare e quantificare con precisione DEG o DET, in particolare negli approcci di sequenziamento di massa. Inoltre, nel sequenziamento di singole cellule, dove è spesso richiesta un’ampia amplificazione della PCR, gli UMI degli omotrimeri si sono dimostrati efficaci nel mitigare gli effetti degli artefatti della PCR, migliorando così sostanzialmente l’affidabilità dei dati di sequenziamento.
“Costruendo UMI da blocchi omogenei di nucleosidi, abbiamo mirato a migliorare la correzione degli errori nel sequenziamento sia a lettura breve che a lettura lunga, dimostrando il nostro impegno nel migliorare le applicazioni della tecnologia di sequenziamento,” afferma Professore associato Adam Cribbsautore senior dell’articolo e leader del gruppo in biologia computazionale.
Questa ricerca ha profonde implicazioni. Correggendo gli errori della PCR negli UMI, aumenta notevolmente l’accuratezza della quantificazione molecolare in varie applicazioni di sequenziamento. È uno strumento vitale per i ricercatori nel sequenziamento di RNA in massa, RNA di singole cellule e DNA, poiché consente analisi accurate dell’espressione genica e del profilo molecolare. La correzione avanzata degli errori UMI riduce l’incidenza di falsi positivi e offre molteplici applicazioni diagnostiche, soprattutto in scenari che richiedono l’analisi longitudinale dei campioni.
Fonte: università di Oxford
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