Una nuova tecnologia sviluppata al MIT consente agli scienziati di etichettare le proteine di milioni di singole cellule in tessuti 3D completamente intatti con velocità, uniformità e versatilità senza precedenti. Utilizzando la tecnologia, il team è stato in grado di etichettare in modo dettagliato interi cervelli di roditori e altri campioni di tessuti di grandi dimensioni in un solo giorno. Nel loro nuovo studio in Biotecnologie naturali, dimostrano inoltre che la capacità di etichettare le proteine con anticorpi a livello di singola cellula nell’intero cervello può rivelare informazioni lasciate nascoste da altri metodi di etichettatura ampiamente utilizzati.
La profilazione delle proteine prodotte dalle cellule è un punto fermo degli studi in biologia, neuroscienze e campi correlati perché le proteine che una cellula esprime in un dato momento possono riflettere le funzioni che la cellula sta cercando di svolgere o la sua risposta alle circostanze, come la malattia. o trattamento. Per quanto le tecnologie di microscopia e di etichettatura siano progredite, consentendo innumerevoli scoperte, agli scienziati mancava ancora un modo affidabile e pratico per monitorare l’espressione proteica a livello di milioni di singole cellule densamente raggruppate in tessuti interi intatti in 3D, come un intero cervello di topo o un cervello di topo. un’intera regione del cervello umano. Spesso confinati in sezioni sottili di tessuto sotto vetrini, gli scienziati non hanno quindi avuto strumenti per apprezzare a fondo l’espressione delle proteine cellulari nell’insieme dei sistemi connessi in cui si verifica.
“Convenzionalmente, lo studio delle molecole all’interno delle cellule richiede la dissociazione del tessuto in singole cellule o il taglio in sezioni sottili, poiché la luce e le sostanze chimiche necessarie per l’analisi non possono penetrare in profondità nei tessuti. Il nostro laboratorio ha sviluppato tecnologie come CLARITY e SHIELD, che consentono l’analisi di interi organi rendendoli trasparenti, ma ora abbiamo bisogno di un modo per etichettare chimicamente interi organi per ottenere utili approfondimenti scientifici”, ha affermato l’autore senior dello studio Kwanghun Chung, professore associato presso il Picower Institute for Learning and Memory, l’istituto Dipartimenti di ingegneria chimica e scienze del cervello e cognitive e l’Istituto di ingegneria e scienza medica del MIT. “Immaginate di marinare una bistecca spessa semplicemente immergendola nella salsa. Gli strati esterni assorbono la marinata rapidamente e intensamente, mentre gli strati interni rimangono in gran parte intatti a meno che la carne non venga lasciata a bagno per un periodo prolungato. Lo stesso principio si applica alla lavorazione chimica dei tessuti: Se le cellule all’interno di un tessuto non vengono processate in modo uniforme, non possono essere confrontate quantitativamente. La sfida è ancora maggiore per l’etichettatura delle proteine, poiché le sostanze chimiche che utilizziamo per l’etichettatura sono centinaia di volte più grandi di quelle contenute nelle marinate. Di conseguenza, possono volerci settimane per questi molecole di diffondersi negli organi intatti, rendendo virtualmente impossibile ed estremamente lento il trattamento chimico uniforme dei tessuti su scala organica.
Il nuovo approccio, chiamato “CuRVE”, rappresenta un grande passo avanti – in preparazione da anni – verso questo obiettivo, dimostrando un approccio fondamentalmente nuovo per elaborare in modo uniforme i tessuti grandi e densi nel loro insieme. Nello studio, i ricercatori spiegano come sono riusciti a superare le barriere tecniche tramite un’implementazione di CuRVE chiamata “eFLASH” e forniscono numerose e vivide dimostrazioni della tecnologia, compreso il modo in cui ha prodotto nuove intuizioni neuroscientifiche.
“Si tratta di un passo avanti significativo, soprattutto in termini di prestazioni effettive della tecnologia”, ha affermato il co-autore principale Dae Hee Yun, ex studente laureato al MIT e ora ingegnere applicativo senior presso LifeCanvas Technologies, una startup fondata da Chung per diffondere gli strumenti inventati dal suo laboratorio. L’altro autore principale dell’articolo è Young-Gyun Park, un ex ricercatore post-dottorato del MIT ora assistente professore al KAIST in Corea del Sud.
Chimica intelligente
Il motivo fondamentale per cui i campioni di tessuto 3D di grandi dimensioni sono difficili da etichettare in modo uniforme è che gli anticorpi penetrano nel tessuto molto lentamente, ma si legano rapidamente alle proteine bersaglio. L’effetto pratico di questa discrepanza di velocità è che immergere semplicemente un cervello in un bagno di anticorpi significherà che le proteine saranno intensamente ben etichettate sul bordo esterno del tessuto, ma praticamente nessuno degli anticorpi troverà cellule e proteine più in profondità all’interno.
Per migliorare l’etichettatura, il team ha ideato un modo – l’essenza concettuale di CuRVE – per risolvere la mancata corrispondenza della velocità. La strategia consisteva nel controllare continuamente la velocità del legame degli anticorpi accelerando allo stesso tempo la permeazione degli anticorpi in tutto il tessuto. Per capire come ciò potrebbe funzionare e ottimizzare l’approccio, hanno costruito ed eseguito una sofisticata simulazione computazionale che ha permesso loro di testare diverse impostazioni e parametri, inclusi diversi tassi di legame e densità e composizioni dei tessuti.
Quindi hanno deciso di implementare il loro approccio nei tessuti reali. Il punto di partenza era una tecnologia precedente, chiamata “SWITCH”, in cui il laboratorio di Chung ha ideato un modo per disattivare temporaneamente il legame degli anticorpi, lasciando che gli anticorpi permeassero il tessuto e quindi riattivando il legame. Oltre a funzionare, ha detto Yun, il team si è reso conto che potrebbero esserci miglioramenti sostanziali se la velocità di legame degli anticorpi potesse essere controllata costantemente, ma le sostanze chimiche utilizzate in SWITCH erano troppo aggressive per tale trattamento in corso. Quindi il team ha esaminato una libreria di sostanze chimiche simili per trovarne una che potesse rallentare in modo più sottile e continuo la velocità di legame degli anticorpi. Hanno scoperto che l’acido desossicolico era un candidato ideale. Usando quella sostanza chimica, il team ha potuto non solo modulare il legame degli anticorpi variando la concentrazione della sostanza chimica, ma anche variando il PH (o l’acidità) del bagno di marcatura.
Nel frattempo, per accelerare il movimento degli anticorpi attraverso i tessuti, il team ha utilizzato un’altra tecnologia precedentemente inventata nel Chung Lab: l’elettrotrasporto stocastico. Questa tecnologia accelera la dispersione degli anticorpi attraverso i tessuti applicando campi elettrici.
L’implementazione di questo sistema eFLASH di dispersione accelerata con velocità di rilegatura continuamente modificabile ha prodotto l’ampia varietà di successi di etichettatura dimostrati nell’articolo. In totale, il team ha riferito di aver utilizzato più di 60 anticorpi diversi per etichettare le proteine nelle cellule dell’intero cervello di topi e ratti; embrioni interi di topo; altri organi interi del topo inclusi polmone e cuore; e blocchi di tessuto cerebrale di animali più grandi, compreso l’uomo.
In particolare, ciascuno di questi campioni è stato etichettato entro un giorno, una velocità “ultraveloce” per organi interi e intatti, hanno detto gli autori. Inoltre, diverse preparazioni non hanno richiesto nuove fasi di ottimizzazione.
Visualizzazioni preziose
Uno dei modi in cui il team ha messo alla prova eFLASH è stato quello di confrontare la loro etichettatura con un altro metodo spesso utilizzato: l’ingegneria genetica delle cellule affinché emettano fluorescenza quando viene trascritto il gene di una proteina di interesse. Il metodo genetico non richiede la dispersione degli anticorpi in tutto il tessuto, ma può essere soggetto a discrepanze perché la segnalazione della trascrizione genetica e l’effettiva produzione di proteine non sono esattamente la stessa cosa. Yun ha aggiunto che mentre la marcatura degli anticorpi segnala in modo affidabile e immediato la presenza di una proteina bersaglio, il metodo genetico può essere molto meno immediato e persistente, rimanendo fluorescente anche quando la proteina reale non è più presente.
Nello studio il team ha utilizzato entrambi i tipi di etichettatura contemporaneamente nei campioni. Visualizzando le etichette in questo modo, hanno visto molti esempi in cui l’etichettatura degli anticorpi e l’etichettatura genetica differivano ampiamente. In alcune aree del cervello dei topi, hanno scoperto che due terzi dei neuroni che esprimono il PV (una proteina prominente in alcuni neuroni inibitori) secondo la marcatura degli anticorpi, non mostravano alcuna fluorescenza su base genetica. In un altro esempio, solo una piccola frazione di cellule che riportavano l’espressione tramite il metodo genetico di una proteina chiamata ChAT la riportavano anche tramite la marcatura degli anticorpi. In altre parole, ci sono stati casi in cui l’etichettatura genetica ha riportato un’espressione proteica gravemente sottostimata o sovrastimata rispetto all’etichettatura anticorpale.
I ricercatori non intendono contestare il chiaro valore dell’utilizzo dei metodi di segnalazione genetica, ma suggeriscono invece che anche l’uso dell’etichettatura degli anticorpi a livello di organo, come consentito da eFLASH, può aiutare a inserire tali dati in un contesto più ricco e completo. Ad esempio, dato che hanno riscontrato casi di significativa sovra-riportazione dell’espressione di PV nei topi (e variazioni significative tra i singoli topi), i ricercatori che utilizzano la marcatura del PV con anticorpi dell’intero cervello potrebbero ottenere una base più profonda per analizzare i cambiamenti geneticamente indicati nella proteina .
“La nostra scoperta di un’ampia perdita regionalizzata di neuroni immunoreattivi PV in topi adulti sani e con un’elevata variabilità individuale sottolinea l’importanza della fenotipizzazione olistica e imparziale”, hanno scritto gli autori.
O come dice Yun, i due diversi tipi di etichettatura sono “due diversi strumenti per il lavoro”.
Oltre a Yun, Park e Chung, gli altri autori dell’articolo sono Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans, Nicholas DiNapoli, Katherine Xie, Seo Woo Choi, Alexandre Albanese, Yuxuan Tian, Chang Ho Sohn, Qiangge Zhang, Minyoung Kim, Justin Swaney, Webster Guan, Juhyuk Park, Gabi Drummond, Heejin Choi, Luzdary Ruelas e Guoping Feng.
I finanziamenti per lo studio provenivano dal Burroughs Wellcome Fund, dal Searle Scholars Program, dal Packard Award in Science and Engineering, dal NARSAD Young Investigator Award, dalla McKnight Foundation, dalla Freedom Together Foundation, dal Picower Institute for Learning and Memory, dal NCSOFT Cultural Fondazione e gli Istituti Nazionali di Sanità.
Da un’altra testata giornalistica. news de www.sciencedaily.com
