Un nuovo Modifica genetica basata su CRISPR è stato sviluppato uno strumento che potrebbe portare a trattamenti migliori per i pazienti affetti da malattie genetiche. Lo strumento è un enzima, AsCas12f, modificato per offrire la stessa efficacia ma con dimensioni pari a un terzo dell’enzima Cas9 comunemente utilizzato per l’editing genetico.
Le dimensioni compatte consentono di impacchettarne una quantità maggiore nei virus portatori e di trasportarli nelle cellule viventi, rendendolo più efficiente. I ricercatori hanno creato una libreria di possibili mutazioni AsCas12f e poi hanno combinato quelle selezionate per progettare un enzima AsCas12f con capacità di modifica 10 volte maggiore rispetto al tipo immutato originale.
Questo AsCas12f ingegnerizzato è già stato testato con successo sui topi e può essere potenzialmente utilizzato per trattamenti nuovi e più efficaci per i pazienti.
Analisi strutturale e scansione mutazionale profonda (DMS) di AsCas12f. Il team ha utilizzato la microscopia elettronica criogenica per osservare la struttura delle molecole biologiche ad alta risoluzione, per analizzare AsCas12f e progettare la loro nuova versione. La “mappa termica” del DMS illustra come tutte le singole mutazioni abbiano influenzato l’attività di modifica del genoma. I quadrati blu indicano una mutazione indesiderata, mentre quelli rossi rappresentano cambiamenti desiderabili. Più scuro è il colore, maggiore sarà l’effetto. Credito immagine: Hino et al. 2023
Ormai probabilmente avrai sentito parlare di CRISPR, lo strumento di modifica genetica che consente ai ricercatori di sostituire e alterare segmenti di DNA. Come i sarti genetici, gli scienziati hanno sperimentato come “tagliare via” i geni che rendono le zanzare portatrici della malaria, alterando le colture alimentari per renderle più nutrienti e deliziose, e negli ultimi anni hanno avviato sperimentazioni sull’uomo per superare alcune delle malattie e dei disordini genetici più difficili.
Il potenziale di CRISPR per migliorare le nostre vite è così fenomenale che nel 2020, le ricercatrici Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier, che hanno sviluppato la versione più precisa dello strumento denominata CRISPR-Cas9, hanno ricevuto il Premio Nobel per la chimica.
Ma anche Cas9 ha dei limiti. Il modo comune per fornire materiale genetico in una cellula ospite è utilizzare un virus modificato come vettore. I virus adeno-associati (AAV) non sono dannosi per i pazienti, possono entrare in molti tipi diversi di cellule per introdurre enzimi CRISPR come Cas9 e hanno meno probabilità di provocare una risposta immunitaria indesiderata rispetto ad altri metodi.
Tuttavia, come ogni servizio di consegna pacchi, esiste un limite di dimensione. “Cas9 è al limite estremo di questa restrizione dimensionale, quindi c’è stata una richiesta per una proteina Cas più piccola che possa essere impacchettata in modo efficiente in AAV e fungere da strumento di modifica del genoma”, ha spiegato il professor Osamu Nureki del Dipartimento di Scienze Biologiche presso l’Università di Tokio.
Le sue grandi dimensioni fanno sì che Cas9 possa mancare di efficienza se utilizzato per la terapia genica. Quindi, un grande team multiistituzionale ha lavorato per sviluppare un enzima Cas più piccolo che sia altrettanto attivo, ma più efficiente. I ricercatori hanno selezionato un enzima chiamato AsCas12f, dai batteri Axidibacillus sulfuroxidans.
Il vantaggio di questo enzima è che è uno degli enzimi Cas più compatti trovati fino ad oggi e ha meno di un terzo delle dimensioni di Cas9. Tuttavia, nei test precedenti non era stata rilevata quasi alcuna attività genomica nelle cellule umane.
Capacità di modifica del genoma delle varianti AsCas12f in tre linee cellulari umane. Questo grafico mostra l’efficienza di due versioni dell’enzima AsCas12f ingegnerizzato nell’editing genetico (seconda e terza colonna in arancione e giallo), rispetto al tipo originale non ingegnerizzato (prima colonna in grigio) e al tipo Cas9 comunemente utilizzato (quarta colonna in blu). Più alta è la barra, più efficiente è lo strumento. Credito immagine: Hino et al. 2023
“Utilizzando un metodo di screening chiamato scansione mutazionale profonda, abbiamo assemblato una libreria di potenziali nuovi candidati sostituendo ciascun residuo aminoacidico di AsCas12f con tutti i 20 tipi di aminoacidi su cui si basa tutta la vita. Abbiamo identificato oltre 200 mutazioni che hanno potenziato l’attività di modifica del genoma”, ha spiegato Nureki.
“Sulla base delle conoscenze acquisite dall’analisi strutturale di AsCas12f, abbiamo selezionato e combinato queste mutazioni di amminoacidi ad attività potenziata per creare un AsCas12f modificato. Questo AsCas12f ingegnerizzato ha più di 10 volte l’attività di modifica del genoma rispetto al solito tipo AsCas12f ed è paragonabile a Cas9, pur mantenendo dimensioni molto più ridotte”.
Il team ha già effettuato sperimentazioni sugli animali con il sistema AsCas12f ingegnerizzato, associandolo ad altri geni e somministrandolo a topi vivi. La somministrazione dei trattamenti direttamente nel corpo è preferibile all’estrazione delle cellule, alla modifica in laboratorio e al reinserimento nei pazienti, operazione che richiede più tempo e denaro.
Il successo dei test ha dimostrato che l’AsCas12f ingegnerizzato ha il potenziale per essere utilizzato per terapie genetiche umane, come il trattamento dell’emofilia, una malattia in cui il sangue non si coagula normalmente.
Il team ha scoperto numerose combinazioni potenzialmente efficaci per progettare un sistema di editing genetico AsCas12f migliorato, quindi i ricercatori riconoscono la possibilità che le mutazioni selezionate potrebbero non essere state le più ottimali di tutte le miscele disponibili.
Come passo successivo, la modellazione computazionale o l’apprendimento automatico potrebbero essere utilizzati per vagliare le combinazioni e prevedere quale potrebbe offrire miglioramenti ancora migliori.
“Elevare AsCas12f per mostrare un’attività di modifica del genoma paragonabile a quella di Cas9 è un risultato significativo e un passo sostanziale nello sviluppo di strumenti di modifica del genoma nuovi e più compatti”, ha affermato Nureki.
“Per noi l’aspetto cruciale della terapia genica è il suo potenziale di aiutare veramente i pazienti. Utilizzando l’AsCas12f ingegnerizzato che abbiamo sviluppato, la nostra prossima sfida sarà la somministrazione della terapia genica per aiutare le persone affette da malattie genetiche”.
Fonte: Università di Tokio
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